بررسی اثر تنش خشکی روی بیان برخی از ژن‌های آنتی‏اکسیدانت درگیاه دارویی کنجد sesamum indicum L.) (

 

چکیده

خشکی به عنوان يکی ازمهم ترين عوامل محدود کننده رشد و توليد گياهان زراعی شناخته شده است. تغييرات فيزيولوژيکی که در اثر کمبود آب در گياه ايجاد می‌شود و صدمات اکسيداتيو بيشترين صدمات را به گیاه وارد می کنند. آنزيمهاىآنتىاكسيدانازجملهمهمترينراهكارهاىدفاعىگياهاندرمهارگونههاىاكسيژنفعالمىباشند. دراينمطالعه،بهجهت بررسی اثر تنش خشکی روی بیان ژن های آنتی اکسیدانت و میزان فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانت در گیاه دارویی کنجد انجام گرفت. ژن های مورد بررسی ، ژن های کاتالاز ، آسکوربات پراکسیداز و پلی فنیل اکسیداز بودند . ژن های بتا اکتین و آلفا توبولین نیز به عنوان ژن های رفرنس انتخاب شدند. به منظور بررسی اثر تنش در 6 دوره زمانی نمونه برداری صورت گرفت. پس از استخراج RNAو ساخت cDNA بررسی بیان ژن با استفاده از QRT-PCR انجام شد. پسازآنپاسخآنزيمى،بياننسبىژنهاىكاتالاز،آسکوربات پراکسیداز و پراکسیداز وبرخىازشاخصهاىفيزيولوژيكى سنجيدهشد. میزان بیان ژن آسکوربات پراکسیداز با گذشت زمان افزايش یافته در مقابل میزان بیان کاتالاز تغییرات منظمی مشاهده نشده است .بيشترفعاليتآنزيمهاىآنتىاكسيداندركناربيانپايدارتروبيشترژنهاى مورد نظرمشاهده شد. افزايشميزانبيانژنآسكورباتپراكسيدازنشاندادكهاينآنزيممىتوانددربرابرتنشخشکیپاسخنشاندادهوكمبودكاتالازراجبراننمايد. نتایج حاصل نشان داد که مقاوم ترین آنزیم برای مقابله با تنش آنزیم آسکوربات پراکسیداز می باشد. این آنزیم از همان روزهای ابتدای تنش افزایش فعالیت نشان داده ولی با افزایش زمان به خاطر آسیب به ساختارهای تولید کننده ی آنزیم ها، کاهش معنی داری را پیدا می کند. افزایش تحمل به خشکی با افزایش بیان ژن های کد کننده ی آنزیم های آنتی اکسیدان همراه شده است. مطالعات نشان می دهد همبستگی بین تحمل به خشکی و ظرفیت دفاع آنتی اکسیدانت وجود دارد.

فهرست مطالب

فصل اول: مقدمه مقدمه..................................................................................................................................19 1-1- کلیات....................................................................................................................19 1-2-1- گیاهان و تنش‌های محیطی.................................................................................21 1-2-2- تنش خشکی......................................................................................................22 1-2-3- لزوم معرفی گیاهان متحمل به خشکی.............................................................23 1-2-4- کاهش رشد گیاه تحت تنش خشکی................................................................24 1-2-5- تنش خشکی و اختلال در فعالیت گیاه............................................................25 1-2-6- مکانیم های تحمل خشکی................................................................................26 1-2-3 آنزیم‌.....................................................................................................................28 1-2-3-1 اصول کلی واکنش های آنزیمی......................................................................29 1-2-3-2 سوپراکساید دیسموتاز..................................................................................29 1-2-3-3 کاتالاز............................................................................................................30 1-2-3-4 آسکوربات پراکسیداز....................................................................................30 1-2-4 بررسی ژن‌های واکنش دفاعی.............................................................................31 1-2-5 بیان ژن.................................................................................................................32 1 -2-6-1 تعریف و مفهوم Real- Time PCR............................................................33 1-2-6-2 استفاده از رنگ‌آمیزی فلورسنت DNA مانند SYBR Green....................34 1-2-6-3 مزایای روش Real- Time PCR...................................................................34 1-2-6-4 روش های سنجش با Real- Time PCR......................................................34 1-2-6-5 روش بررسی کمی بیان ژن یا quantetive real-time PCR......................37 1-2-6-6 آنالیز کمی mRNAبا استفاده از Real- Time PCR....................................37 2 بررسی منابع....................................................................................................................43 2-1 تاثیر تنش خشکی بر بیان ژن‌ها................................................................................46 3 مواد و روش‌ها..................................................................................................................49 3-1 تهیه مواد گیاهی........................................................................................................49 3-2 تعیین سطح تنش خشکی القاشده به گیاه ..............................................................49 3-3 اندازه‌گیری صفات مورفولوژی...................................................................................50 3-4 مطالعات بیوشیمیایی..................................................................................................51 3-4-1 سنجش فعالیت آنزیم‌ها........................................................................................51 3-4-1-1 تهیه عصاره گیاهی............................................................................................51 3-4-1-2 استخراج پروتئین............................................................................................52 3-4-1-2-1 روش اندازه‌گیری میزان پروتئین کل.........................................................52 3-2-1-2-2 رسم منحنی استاندارد...............................................................................52 3-2-1-3 فعالیت آنزیمی آسکوربات پراکسیداز...........................................................53 3-2-1-4 فعالیت آنزیمی کاتالاز.....................................................................................54 3-2-1-5 فعالیت آنزیمی سوپر اکسید دیسموتاز..........................................................54 3-2-1-6 فعالیت آنزیمی سوپراکسید از........................................................................55 3-2-1-7 سنجش میزان پرولین .....................................................................................55 3-2-2 تجزیه‌وتحلیل آماری.............................................................................................56 3-3 مطالعات مولکولی......................................................................................................56 3-3-1 استخراج RNA ....................................................................................................56 3-3-1-1 استخراج RNA با روش ترایزول......................................................................56 3-3-1-2 بررسی کیفیت و کمیت RNA استخراج‌شده.................................................57 3-3-2-1 الکتروفورز.......................................................................................................57 3-3-2-2 اسپکتروفتومتری...........................................................................................57 3-3-3 تیمار نمونه های RNA استخراج‌شده با آنزیم DNase.....................................58 3-3-4 سنتز c DNA تک‌رشته‌ای از RNA کل...........................................................58 3-3-5 Real-Time PCR.............................................................................................59 3-3-5-1 بررسی بیان ژن‌های آنتی‌اکسیدانتی............................................................59 3-3-5-2 بهینه‌سازی شرایط واکنش Real-Time PCR.........................................59 3-3-5-3 کنترل آلودگی Real-Time PCR.............................................................60 3-3-5-4 چرخه های حرارتی Real-Time PCR.....................................................60 3-3-6 تجزیه‌وتحلیل مشاهدات...................................................................................60   فصل چهارم: نتایج.........................................................................................................63 4-1 استخراج RNA کل از بافت برگ و ریشه.............................................................63 4-2 طراحی پرایمر........................................................................................................64 4-2-1 Melting curve................................................................................................65 4-3 نتایج بررسی بیان ژن با استفاده از روش Real Time PCR.............................67 4-3-1 الگوی تظاهر ژن سوپراکسید دیسموتاز...........................................................67 4-3-2 فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز................................................................69 4-3-3 الگوی تظاهر ژن کاتالاز.....................................................................................70 4-3-4 فعالیت آنزیم کاتالاز..........................................................................................72 4-3-5 الگوی تظاهر ژن پلی فنل اکسیداز..................................................................73 4-3-6 فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز.................................................................74 4-4 نتیجه گیری.............................................................................................................77 4-5 پیشنهادات..............................................................................................................78   فصل پنجم: منابع..............................................................................................................80   پیوست‌ها

شکل2-1 ....................................................................................................................................54

شکل 3-1...................................................................................................................................59

شکل 4-1 ...................................................................................................................................60

شکل 4-2....................................................................................................................................60

شکل 4-3..................................................................................................................................63

شکل 4-4...................................................................................................................................64

شکل 4-5...................................................................................................................................66

شکل 4-6...................................................................................................................................66

شکل 4-7..................................................................................................................................67

شکل 4-8..................................................................................................................................68

شکل 4-9..................................................................................................................................69

شکل 4-10..................................................................................................................................70

شکل 4-11..................................................................................................................................71

شکل 4-12 ................................................................................................................................72

شکل 4-13.................................................................................................................................72

شکل 4-14.................................................................................................................................73

فهرست جداول

جدول2-1...................................................................................................................................46

جدول 3-1.................................................................................................................................57

جدول 3-2.................................................................................................................................57

جدول 3-3................................................................................................................................58

جدول 3-4.................................................................................................................................59

جدول 4-1...................................................................................................................................61

جدول 4-2 .................................................................................................................................61

فصل اول

مقدمه

1-1 مقدمه

کنجد (Sesamum indicum L.) گیاه یک‌ساله، خودگشن با دیرینه زراعی طولاني که به علت دارا بودن درصد زیاد روغن و مقدار مناسب پروتئین به‌عنوان یک منبع تغذیه‌ای محسوب می‌شود (نصر، 1382). سطح زیر کشت جهاني كنجد در سال 2010 میلادی، در میان 10 کشور عمده تولیدکننده کنجد در جهان، کشور میانمار با تولید 000/720 تن در رتبه اول تولید قرار دارد. کشور هند با تولید 000/620 تن در رتبه دوم و چین با تولید 000/590 تن در رده سوم قرار دارد که در این‌ بین ایران با تولید 31848 تن در رده دهم قرار دارد. متوسط عملکرد کنجد در جهان در این سال 490 کیلوگرم در هکتار بوده است (فائو، 2010). مناطق اصلی کشت کنجد در کشور استان‌های فارس، خوزستان، جیرفت،بوشهر،اردبیل (مغان)،خراسان شمالی می‌باشد. پنج استان فارس، خوزستان، جیرفت،خراسان رضوی و اردبیل همه‌ساله 80 درصد سطح زیر کشت کنجد کشور را به خود اختصاص داده‌اند. در سال 1391 سطح زیر کشت کنجد در کشور به 43475 هکتار با تولید 39614 تن و عملکرد 912 کیلوگرم در هکتار بوده است.

کنجد به اسامی Till, Simsim, Gingelly, Benni,Seed معروف است. كنجد از دانه‌های روغني مناطق گرم و نيمهگرم است، ولي كشت ارقام جديد آن به مناطق معتدله نيز گسترش‌یافته است. اين گياه داراي ارقام محلي زيادي است و در اغلب كشورها توسط كشاورزان خرده‌مالک و به‌صورت سنتي كشت و كار می‌شود (وایز، 2000). مقدار روغن در زمان رسيدگي فيزيولوژيكي به سطح ثابتي می‌رسد و تا زمان رسيدگي بذر نوسان اندكي دارد (فلوئر و داونی، 1970). آبياري می‌تواند موجب افزايش مقدار روغن شود، درصورتی‌که تنش خشكي (میلر و رایتن، 1987) موجب كاهش آن می‌شود و به‌طورکلی عوامل محيطي اثرات معكوس بر مقدار روغن و پروتئين دارند. ازنظر درصد روغن و عملكرد روغن دانه ارقام مقاوم به تنش موفق‌تر عمل می‌نمایند (اسمیت، 1990). کشور ایرانازنظر اقلیمی در منطقه خشک نیمه‌خشک دنیا قرار دارد، ازاین‌رو خشکی یکی از مشکلات پیش روی زراعت کشور ماست. خشکی سبب تغییرات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی متعددی در گیاهان می‌شود ضمن اینکه تحمل به خشکی در گیاهان نیز خصوصیتی ثابت نبوده و ممکن است در مراحل مختلف رشد هرگونه، متفاوت باشد (سایرام،2001). به‌طورکلی گیاهان، طیف وسیعی از تنش‌های محیطی را که نهایت منجر به بروز تنش اکسیداتیو می‌شود، درک می‌کنند. مکانیسم مقاومت در برخی از تنش‌ها به‌صورت یک ارتباط درونی و نتیجه یک برنامه‌ریزی هماهنگ و پیچیده است. در شرایط تنش عدم توازن بین فرآیند جذب انرژی و مصرف آن توسط اندام فتوسنتزی باعث تولید انواع اکسیژن فعال (ROS) و ناتوانی گیاه در مهار آن می‌گردد که درنهایت منجر به بروز تنش در غشای سلول و بروز علائم ناشی از صدمات اکسیداتیو شود (بلوخینا و همکاران، 2003). افزايش ميزان رادیکال‌های فعال اکسيژن در گياه باعث مي‏شود که برای کاهش اثرات سمي تنش اکسيداتيو ناشي از تنش خشکی، مکانيسم‌هاي متنوعي در گياه فعال شود. در اين شرايط ميزان آنتی‌اکسیدانت­ها افزایش‌یافته و آنزیم‌های مهارکننده ROSها در جهت کاهش اثرات سمي ناشي از تنش اکسيداتيو حاصل از تنش خشکی، افزايش پيدا مي‌کنند (كافي و همكاران،1382). برای مقابله با تنش اکسیداتیو آنزیم‌های آنتی­‌اکسیدانت نظیر کاتالاز (CAT)، پراکسیداز (POD)، آسکوربات پراکسیداز (APX)، سوپر­اکسید ­دیسموتاز (SOD) و گلوتاتیون ردوکتاز (GR) باعث حذف و غیرفعال شدن گونه های فعال اکسیژن می‏شوند (دیرینک و مونتاگو،2002).

لذا بررسی اثرات تنش خشکی و الگوی رفتاری آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت، می‌تواند به درک مکانیسم‌های دخیل در القاء مقاومت یا تحمل به گیاه کمک نماید، چراکه همبستگی بالایی در تحمل به تنش‌های محیطی و تغییرات غلظت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت در گیاهان فتوسنتز کننده وجود دارد. از سوی دیگر با عنایت به اینکه سنتز هر ماده‌ای در سلول تحت کنترل ژن‌های مسئول سنتز آن است انتقال این ژن­ها به گیاهان دیگر و تولید ارقام محتمل به خشکی دور از ذهن نخواهد بود.

اهداف تحقیق حاضر عبارت‌اند از:

1- مقایسه الگوی بیان برخی ژن‌های دخیل در تنش خشکی در سطح آنزیمشامل کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز و آسکوربات پراکسیدازو پراکسیداز در بافت برگ و ریشه

2- بررسی الگوی بیان برخی ژن‌های دخیل در تنش خشکی در سطح ترانسکریپتوم

1-2 کلیات

1-2-1 گیاهان و تنشهای محیطی

گیاهان در دوره حیاتشان با انواع تنشهای محیطی مواجه می‌شوند، این تنش‌ها شانس نمو و بقای گیاهان را محدود می‌کنند. در بسیاری از نقاط کره خاکی شرایط مناسب رشد فقط برای مدت کوتاهی دوام دارد و گیاهان مجبورند که در همین زمان کم، مراحل اساسی رشد خود را انجام دهند در برخی نقاط هم که شرایط برای رشد مناسب است، افزایش تراکم و تعداد گیاهان عامل ایجاد رقابت برای گیاهان در به دست آوردن مواد غذایی، آب و نور است (لارچر و همکاران، 2001).

درمجموع تنش یعنی شرایط نامناسبی که حتماً مرگ آنی در پی نداشته و به‌طور دائم یا موقت در یک محل اتفاق می‌افتد ولی بر عملکردهای حیاتی موجودات تاثیرداشته باشد (والتر و همکاران، 1985). از قوانین حرکت نیوتن چنین استنباط شده است که اگر هر موجودی تحت تاثیرعملی (تنش) قرارگیری عکس‌العملی (واکنش) از خود نشان می‌دهد. واکنش می‌تواند برگشت‌پذیر یا برگشت‌ناپذیر باشد. اگر واکنش از شدت کافی برخوردار باشد موجود زنده دچار یک تغییر پایدار یعنی صدمه یا مرگ می‌شود.

به‌هرحال دانشمندان علوم گیاهی تنش را با دو تعریف بوم‌شناختی و بیوشیمیایی موردتوجه قرار می‌دهند. تنش در مفهوم بوم‌شناختی: فشارهای زیست‌محیطی است که نسبت تولید ماده خشک را در قسمتی از گیاه یا تمامی آن محدود می‌کند اما تنش ازنظر بیوشیمیایی به معنی اختلال در تولید طبیعی ترکیبات مختلف گیاهی است. امروزه تنش را به دو گروه طبقه‌بندی می‌کنند اول تنش‌های زیستی^[1]: تنش‌هایی که حاصل حمله یک موجود زنده به موجود زنده دیگر است مانند آفت‌ها، پاتوژنها و آللوپاتی؛ دوم تنش‌های غیر زیستی^[2] شامل:

1- باد، فشار، صدا، نیروهای مغناطیسی و الکتریکی

2- شیمیایی، مثل شوری، یونی، علف‌کش‌ها و...

3- تشعشع، مثل پرتوهای A-B, UV- UV

4-آب، مثل غرقابی و خشکی

5- دما، مثل گرماو سرما

هر نوع از تنش‌ها در وهله اول تنش اولیه محسوب شده و منجر به تغییراتی در سیستم زیستی می‌شود.

اگر مدت‌زمان تنش اولیه کوتاه باشد اثرات آن در حد چند ثانیه یا دقیقه مشاهده می‌شوند؛ اما اگر مدت‌زمان بروز تنش طولانی باشد تنش ثانویهپدید آمده و آسیب حاصل از آن غیرمستقیم خواهد بود. گیاهان نیزمانندجانوران برای مقابله با این شرایط ناسازگارو سخت با استفاده از مکانیسم‌های متفاوت با تنش مقابله می‌نمایند که این مکانیزم‌ها شامل سازش و مقاومت بوده که مقاومت خود شامل تحمل کردن، اجتناب و فرار می­باشد (پارساد، 1996).

همه این تنش‌ها، پاسخ‌های مشترکی را در گیاهان القا می‌کنند ولی در شروع سیگنال باهم تفاوت داشته و همچنین گیرنده‌های آن‌ها متفاوت می‌باشند. این تنش‌ها با بیان یک سری از ژن‌ها گیاه راقادربه ترمیم آسیب ناشی از تنش کرده یا گیاه رادر برابر تنشهای محیطی که آینده پیش خواهد آمد حمایت می‌کنند (باجوز و همکاران، 2008)؛ یعنی درواقع گیاه را با محیط سازگار کرده و بقای آن را بیشتر تأمین و تضمین می‌کنند و از این طریق به‌نوعی با محیط خود سازش یافته یا تطابق می‌یابند. سازش‌ها اعم از مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی به نحوی انجام می‌گیرد که گیاه بتواند بهتر با محیط تطابق پیدا کند و از امکانات مادی محیط خود به گونه شایسته‌ای استفاده کند. به‌طور مثال سازش بیوشیمیایی در گیاهان شامل انواع تغییرات بیوشیمیایی در سلول است. این تغییرات شامل تکامل راههای متابولیکی جدید، تجمع متابولیک‌های با وزن مولکول کم، سنتز پروتئین‌های خاص، مکانیسم‌های سم‌زدایی و تغییر در میزان فیتوهورمونها می‌باشند (باجوز و همکاران، 2008). در اغلب تنشهای محیطی، تغییرات ایجادشده گیاهان را در مواجهه با تنش کمک می‌کنند. یکی از عمده‌ترین تنشهای محیطی که اغلب گیاهان با آن مواجه­اند تنش خشکی می­باشد.

1-2-2 تنش خشکی

تنش خشكی زمانی در گیاه حادث می‌شود كه میزان آب دریافتی گیاه كمتر از تلفات آن باشد. این امر ممكن است به علت اتلاف بیش‌ازحد آب یا كاهش جذب ویا وجود هر دو مورد باشد (کوچکی،1374). یكی از نشانه‌های كمبود آب، كاهش تورژسانس و درنتیجه رشد و توسعه سلول به‌ویژه در ساقه و برگ‌ها است. به همین دلیل اولین اثر محسوس کم‌آبی را می‌توان از اندازه کوچک‌تر برگ‌ها یا ارتفاع گیاهان تشخیص داد. به دنبال كاهش سطح برگ، جذب نور نیز كم شده و باعث كاهش ظرفیت كل فتوسنتزی گیاه شده و رشد و درنهایت عملكرد آن دچار نقصان می‌شود (حسنی، 1385). خشكی بر جنبه‌های مختلف رشد گیاه تاثیر گذاشته و موجب كاهش و به تأخیر انداختن جوانه‌زنی، كاهش رشد اندام‌های هوایی کاهش تولید ماده خشك می‌گردد. درصورتی‌که شدت تنش خشکی زیاد باشد، موجب كاهش شدید فتوسنتز، مختل شدن فرآیندهای فیزیولوژیكی، توقف رشد و سرانجام مرگ گیاه می‌شود (سینگ و همکاران، 1996). كمبود آب ازمهم‌ترین مشكلات مناطق خشك و نیمه‌خشک می­باشد كه بر روی رشد و نمو گیاهان اثر می‌گذارد (اهدایی، 1372). نواحی خشك و نیمه‌خشک مناطقی هستند كه كل تعرق گیاهان در آن 50% تعرق در شرایط بدون تنش ویا حتی كمتر از این مقدار باشد. متأسفانه كمبود آب تنها منحصر به این نواحی نمی‌شود، بلكه حتی در شرایط آب‌وهوای مرطوب و یا توزیع نامنظم بارندگی نیز منجر به محدود شدن آب قابل‌دسترس و درنتیجه كاهش رشد گیاه می‌شود (کافی، 1384). در كشور ما به‌جز سواحل دریای خزر و قسمت‌های كوچكی از شمال غربی كشور بقیه مناطق جزء مناطق خشك و نیمه‌خشک محسوب می‌شوند. این در حالی است كه مناطق خشك كشور نسبت به مناطق نیمه‌خشک آن از وسعت بیشتری برخوردار است (اهدایی، 1372).

1-2-3 لزوم معرفی گیاهان متحمل به خشکی

5/۹۷درصد آب‌کره زمین در دریاها و دریاچه‌ها است که آب‌شور را تشکیل می‌دهد. 5/۲ درصد باقیمانده آب شیرینی است که در زمین وجود دارد که از آن ۳/۰درصد آب رودخانه‌ها ۸/۳۰ درصد آب‌های زیرزمینی و ۹/۶۸ درصد یخچال‌ها و پوشش دائمی برف کوه‌ها است. کشور ايران به خاطر قرار گرفتن در كمربند خشك جغرافيايي و نوار بياباني كه در 25تا 40درجه عرض شمالي واقع‌شده است، از شرايط آب‌وهوایی برخوردار است كه جزو مناطق كم باران جهان بشمار می‌آید. باوجود قرارگرفتن کشور ايران در کمربند خشک جهانيتغییرپذیری شديد اقليمي، بارش تنها معادل یک‌سوم متوسط جهاني می­باشد (حيدري شریف‌آباد و همکاران،1381). بر اساس گزارش‌ها در سال 1380حدود 2/6ميليون هکتار زراعت آبي و 4ميليون هکتار زراعت ديم و 1/1ميليون هکتار از باغات تحت تاثیرداشته خشک‌سالی قرارگرفته‌اند. خسارت ناشي از خشک‌سالی بر باغات در اين سال بالغ‌بر 520ميليون دلار بود. بر اساس تحقيقات انجام‌گرفته در کشور، اثر مستقيم خسارت ناشي از کاهش هر 1میلی‌متر بارندگي برابر 98ميليارد ريال است (غفاری،1386).ﺗﻨﺶ ﺧﺸﻜﻲ ﺑﻴﺶ از ﻫﺮ ﻋﺎﻣﻞ دﻳﮕﺮي ﻣﻮﺟﺐ ﻛﺎﻫﺶ رﺷﺪ و ﺗﻮﻟﻴﺪ ﮔﻴﺎﻫﺎن می‌گردد. ﺑﻬﺘﺮﻳﻦ راه ﻣﻘﺎﺑﻠﻪ ﺑﺎ ﺧﺸﻜﻲ اﺳﺘﻔﺎده ﺑﻬﻴﻨﻪ از آب و اﺻﻼح ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺑﺮاي اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪ ﺧﺸﻜﻲ اﺳﺖ. ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪ ﺧﺸﻜﻲ، ﺗﻮاﻧﺎﻳﻲ ﮔﻴﺎه ﺑﺮاي رﺷﺪ ﻣﻄﻠﻮب در ﺷﺮاﻳﻂ ﺗﻨﺶ است.

1-2-4 کاهش رشد گیاه تحت تنش خشکی

ﺑﻴﺶ از 80 درﺻﺪ ﺑﺎﻓﺖ ﮔﻴﺎﻫﻲ را آب ﺗﺸﻜﻴﻞ می‌دهد (مارشال، 1986)و ﻛﻤﺒﻮد آن در ﮔﻴﺎﻫﺎن ﻋﻮارض ﺷﺪﻳﺪي را به‌سرعت آﺷﻜﺎر می‌سازد ومهم‌ترین ﻋﺎﻣﻞ ﻣﺤﺪودﻛﻨﻨﺪه رﺷد و ﻧﻤﻮ ﮔﻴﺎﻫﺎن ﻣﺤﺴﻮب می‌شود. ﺑﺮاي اﻳﻨﻜـﻪ ﮔﻴـﺎه ﺑﺘﻮاﻧـﺪ آب ﺟﺬب ﻛﻨﺪ، ﺑﺎﻳﺴﺘﻲ ﭘﺘﺎﻧﺴﻴﻞ آب سلول‌های رﻳﺸﻪ ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ اﻃـﺮاف آن ﻛﻤﺘـﺮ ﺑﺎﺷـﺪ (هوگنبوم، 1987). درواقع در ﺷـﺮاﻳﻂ ﺗـﻨﺶ ﺧﺸﻜﻲ ﭘﺘﺎﻧﺴﻴﻞ آب ﻣﺤﻴﻂ ﮔﻴﺎه منفی‌تر از ﺷﺮاﻳﻂ ﻃﺒﻴﻌﻲ ﺑﻮده و ﺟﺬب آب ﺗﻮﺳﻂ ﮔﻴﺎه ﺑﺎ ﻣﺸﻜﻞ ﻣﻮاﺟﻪ می‌شود. ﺗﺤﻘﻴﻘﺎت ﺑﺴﻴﺎري در ﻣﻮرد ﺗﺄﺛﻴﺮ ﻛﻤﺒﻮد آب ﺑﺮ رﺷﺪ و ﻧﻤﻮ ﮔﻴﺎﻫﺎن انجام‌شده اﺳـﺖ اﻳـﻦ ﺗﺤﻘﻴﻘـﺎت ﺣـﺎﻛﻲ از آن اﺳﺖ ﻛﻪ ﻛﺎﻫﺶ رﺷﺪ ﺑﻪ دﻻﻳﻞ ﻣﺨﺘﻠﻔﻲ ﺣﺎدث می‌شود. وﻗﺘﻲ ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺑﻪ آب ﻛﺎﻓﻲ دﺳﺘﺮﺳﻲ ﻧﺪاﺷﺘﻪ ﺑﺎﺷﻨﺪ، ﻣﻘﺪار مواد ﺑﺎزدارﻧﺪه رﺷﺪ ازجمله آﺑﺴﻴﺰﻳﻚ اﺳﻴﺪ، در ﮔﻴﺎه اﻓـﺰاﻳﺶ می‌یابد. از ﻃﺮﻓـﻲ ﺑﺮﺧـﻲ از ﻣﺤﻘﻘـﺎن ﻛـﺎﻫﺶ ﻣﻘـﺪار هورمون‌های ﻣﺤﺮك رﺷﺪ ﻣﺎﻧﻨﺪ اکسین­ها، جیبرلین‌ها ﺳﻴﺘﻮﻛﻴﻨﻴﻦ­ﻫﺎ در ﮔﻴﺎه را براثر ﻛﻤﺒﻮد آب ﮔـﺰارش کرده‌اند (فهیمی،1996).درﮔﻴﺎﻫﺎن ﻧﺨﺴﺘﻴﻦ آﺛﺎر ﻛﻤﺒﻮد آب به‌صورت ﺑﺴﺘﻪ ﺷﺪن روزنه‌ها ﺑﺮوز می‌کند. ازآنجایی‌که ﺑـﺮاي اﻧﺠـﺎم ﻋﻤـﻞ ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰ ﺗﺒﺎدﻻت ﮔﺎزي ﺿﺮوري اﺳﺖ، ﺑﻨﺎﺑﺮاﻳﻦ، در اﺛﺮ ﻛﻤﺒﻮد آب و ﺑﺴﺘﻪ ﺷﺪن روزنه‌ها ﺗﺒﺎدﻻت ﮔﺎزي کاهش‌یافته و درنتیجه کربن مونواکسید ﻛﻤﺘﺮي در دﺳﺘﺮس ﮔﻴﺎه ﻗﺮار می‌گیرد و شدت ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰ ﻛﺎﻫﺶ می‌یابد (مارتین و رزای،1992). ﺗﻨﺶ ﺧﺸﻜﻲ از ﻃﺮﻳﻖ ﻋﻮاﻣﻞ ﻏﻴﺮ روزنه‌ای ﻧﻴﺰ ﺑﺮ ﺷﺪت ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰ تاثیر می‌گذارد. ﺑﻄﻮرﻳﻜﻪ واکنش‌های ﺑﻴﻮﺷﻴﻤﻴﺎﻳﻲ ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰ همچنین دﺳﺘﮕﺎه ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰي در اثر ﻛﻤﺒﻮد آب آسیب‌دیده و درنتیجه ﺷﺪت ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰ ﻛﺎﻫﺶ می‌یابد. ﻋﻼوه ﺑـﺮ اﻳـﻦ در ﺷﺮاﻳﻂ ﺗﻨﺶ ﺧﺸﻜﻲ ﺳﻄﺢ ﺑﺮگ ﻧﻴﺰ کاهش‌یافته و اﻳﻦ امر نیز ﺑﺎﻋﺚ ﻛﺎﻫﺶ ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰ ﺧـﺎﻟﺺ می‌شود (استراک، 1981). تنش خشکی با کاهش سطح برگ، انسداد روزنه­ها، کاهش فعالیت­های پروتوپلاسمی و تثبیت گازکربنیک، کاهش سنتز پروتئین و کلروفیل سبب تقلیل فرایند فتوسنتز می­گردد (امام، 1383).

جانسون و هرتز ثابت کرده­اند که پتانسیل آب برگ میزان فتوسنتز را مستقیماً تحت تاثیر قرار می­دهد. با افزایش تنش آب فتوسنتز تا نقطه فتوسنتز کاهش می­یابد و به‌طور مستقیم بر فرایندهای بیوشیمیایی مربوط به فتوسنتز اثر گذاشته و به‌طور غیرمستقیم ورود گازکربنیک به داخل روزنه­ها را که به علت تنش آب مسدود باشند را کاهش می­دهد (فائو، 2005).

شرایط تنش شدید تنفس، جذب گازکربنیک، انتقال مواد فتوسنتزی و انتقال مواد خام در آوندهای چوبی به حد بسیار کم نزول کرده و این در حالی است که فعالیت آنزیم‌های هیدرولیز کننده افزایش می­یابد، کاهش مواد فتوسنتزی موجب اشباع برگ­ها از این مواد می­گردد. درنهایت کاهش فتوسنتز را در پی خواهد داشت (کوچکی،1365).

بویر با تشریح فیزیولوژیکی غلات تحت تنش اظهار داشته تنش رطوبتی موجب کاهش فتوسنتز، پیری زودرس و ریزش برگ­های پایین گیاه می­گردد (بویر، 1995). در شرايط تنش كاهش ماده خشك می‌تواند به دليل فشار آماس سلول ناشي از كاهش سطح برگ گياه همچنين كاهش نرخ فتوسنتزی به دليل محدودیت‌های بيوشيميايي ناشي از كمبود آب از قبيل كاهش رنگ‌دانه‌های فتوسنتزی به‌خصوص كلروفيل ها باشد (لاولر،2002).

1-2-5 تنش خشکی و اختلال در فعالیت گیاه

تغييرات فيزيولوژيکی که در اثر کمبود آب در گياه ايجاد می‌شود، صدمات اکسيداتيو نيز از عوامل مهم محدودکننده رشد و توليدات گياهی هستند که در اثر عدم وجود شرايط مناسب ايجاد می‌شود. بيشترين صدمه در گياهان صدمه اکسيداتيو در سطح سلول است (آلن،1995). آلن گزارش کرده است که بيشترين خسارت در گياهان که از طريق تنشهای مختلف اعمال می‌شود، در ارتباط با خسارت اکسيداتيو در سطوح مختلف سلولی است. ارگانیزم‌های فتوسنتز کننده هوازی در طول دوره زندگی در معرض ميزان متفاوتی از سمومی هستند که اين سمیت در گياهان عالی از کمبود آب حادتر است (سایرام وهمکاران، 2001). نتايج مطالعات نشان می‌دهد در شرايط تنش وحتی تحت غلظت‌های بالای CO₂ محيطی، بازهم فتوسنتز کاهش می‌یابد که بیان‌کننده اين امر است که دستگاه فتوسنتز صرف‌نظر از بسته شدن روزنه‌ها، تحت تاثیر قرارگرفته است. در شرايط تنش کمبود آب روزنه‌ها در گياه بسته می‌شوند و متعاقب آن غلظت CO₂ در بافت مزوفيل کاهش می‌یابد و به دنبال اين وضعيت واکنش‌های تاريکی فتوسنتز مختل شده و محصولات حاصل از واکنش‌های روشنایی که شامل ATP، NADPH است، مصرف نمی‌شود. در چنين شرايطی به دليل عدم اکسيد شدن مولکول NADPH، مصرف NADP+ جهت دريافت الکترون کاهش می‌یابد، بنابراين مولکول اکسيژن در مسير زنجيره انتقال الکترون به‌عنوان پذيرنده جانشين الکترون عمل می‌کند و منجر به شکل‌گیری راديکال سوپر اکسيد (O₂^-)، پر اکسيد هيدروژن (H₂O₂) و راديکال هیدروکسید (OH^-) می‌گردد (سایرام و همکاران،2000؛تارکان،2005). فعاليت گونه‌های فعال اکسيژن^[3] (ROS) ممكن است سبب بروز صدماتی همچون اكسيد شدن ليپيدها، (درنتیجه منجر به تغيير ساختار غشاء و درنتیجه ازهم‌پاشیدگی يكپارچگي آن می‌شود)، تغيير ساختمان پروتئین‌ها و اكسيد شدن گروه‌های سولفید­ریل (‌-SH)، غیرفعال شدن آنزیم‌ها، بی‌رنگ شدن و یا از بين رفتن رنگ‌دانه هادی مانند کلروفيل و ساير ترکيبات رنگیزه‌ای و هم‌چنین حمله مداوم به مولکول‌های آلي مثل DNA و درنتیجه اختلال در رشته‌های DNA گردد(حبیبی و همکاران، 2004؛ موهنتی، 2003؛ میتلر و همکاران، 2002).

 

1-2-6 مکانیسم­های مقاومت به خشکی در گیاهان

گیاهان دارای مکانیزم­های مختلفی برای مواجه با تنش می‌باشند. ﻓﺮار از ﺧﺸﻜﻲ یکی از مکانیم هاست ﻛﻪ ﮔﻴﺎه ﺗﻼش می‌کند ﺑﺎ رﺷﺪ ﺳﺮﻳﻊ و کوتاه‌مدت ﺧﻮد ﻗﺒﻞ از ﺗﺨﻠﻴﻪ رﻃﻮﺑﺖ ﺧﺎك ﺑﺬرﺗﻮﻟﻴﺪ ﻛﻨﺪ. ﺗﺤﻤﻞ ﺑﻪ ﺧﺸﻜﻲ مکانیزم دیگری است که ﺗﻮﺳﻂ ﺗﻨﻈﻴﻢ اﺳﻤﺰي، اﻓﺰاﻳﺶ ﻗﺎﺑﻠﻴﺖ ارﺗﺠﺎع، ﻛﺎﻫﺶ اﻧﺪازه ﺳﻠﻮل و آب ﻛﺸﻴﺪﮔﻲ از ﻃﺮﻳﻖ ﺗﺤﻤﻞ ﭘﺮوﺗﻮﭘﻼﺳﻤﻲ و ﺗﻐﻴﻴﺮ در ﺧﺼﻮﺻﻴﺎت دﻳﻮاره ﺳﻠﻮﻟﻲ از روش‌های ﺗﺤﻤﻞ ﮔﻴﺎه به شمارمی رود. (نیلسون و ارکوت، 1996؛ کوچکی و همکاران، 1372) ﺗﻨﻈﻴﻢ اﺳﻤﺰي با ﻛﺎﻫﺶ ﭘﺘﺎﻧﺴﻴﻞ اﺳﻤﺰي ﺑﻪ ﻋﻠﺖ ﺗﺠﻤﻊ ﻣﻮاد ﺣﻞ ﺷﻮﻧﺪه در ﭘﺎﺳﺦ ﺑﻪ ﻛﻤﺒﻮد آب ایجاد می‌شود. ﭘﺘﺎﻧﺴﻴﻞ اﺳﻤﺰي در داﺧﻞ ﺳﻠﻮل ﺑﺎ اﺿﺎﻓﻪ ﻳﺎ ﺣﺬف ﻛﺮدن ﻣﻮاد ﺣﻞ ﺷﻮﻧﺪه از ﺳﻠﻮل انجام می­شود ﺗﺎ زﻣﺎﻧﻲ ﻛﻪ ﭘﺘﺎﻧﺴﻴﻞ اﺳﻤﺰي درون ﺳﻠﻮل ﺑﺎ ﭘﺘﺎﻧﺴﻴﻞ ﻣﺤﻴﻂ اﻃﺮاف ﺳﻠﻮل تقریبا ﺑﺮاﺑﺮ ﺷﻮد و اﻳﻦ ﻣﻮرد اﻏﻠﺐ ﺑﺮاي ﮔﻴﺎﻫﺎن ﭘﺴﺖ ﺑﻜﺎر می‌رود. ﭘﺘﺎﻧﺴﻴﻞ آب ﻛﻞ می‌تواند در ﻫﻨﮕﺎم بروز ﺧﺸﻜﻲ ﺗﻮﺳﻂ تنظیم اﺳﻤﺰي ﺑﺎ ﻛﺎﻫﺶ ﻣﻴﺰان پتانسیل آب ﺳﻠﻮل و ﻳﺎ افزایش مواد ﺣﻞ ﺷﻮﻧﺪه و با دﺧﺎﻟﺖ ﻗﻨﺪﻫﺎ ﺗﻨﻈﻴﻢ ﮔﺮدد و ﺑﺴﺘﻪ ﺑﻪ ﮔﻮﻧﻪ ﮔﻴﺎﻫﻲ، اسمولیتها اﺻﻠﻲ و ﻛﻠﻴﺪي در ﺗﻨﻈﻴﻢ اﺳﻤﺰي ﻣﺘﻔﺎوت اﺳﺖ. ﺑﺮاي ﻣﻮاد ﺗﺠﻤﻊ ﻳﺎﻓﺘﻪ اﺛﺮات ﻣﺨﺘﻠﻔﻲ گزارش‌شده اﺳﺖ. اﻳﻦ ﻣﻮاد می‌توانند ﺑﺎ اﻓﺰاﻳﺶ ﻧﮕﻬﺪاري آب و ﺣﻔﻆ ﭘﺘﺎﻧﺴﻴﻞ تورگر ﺳﺒﺐ ﺗﻨﻈﻴﻢ اﺳﻤﺰي ﺷﻮﻧﺪ. در ﺗﻌﺪادي از واکنش‌های ﺑﻴﻮﺷﻴﻤﻴﺎﻳﻲ ﺟﺎﻧﺸﻴﻦ آبگردند و ﻫﻤﭽﻨﻴﻦ ﺑﺎ ﻟﻴﭙﻴﺪﻫﺎ ﭘﻴﻮﻧﺪ داده و از ﺗﺨﺮﻳﺐ ﻏﺸﺎء جلوگیری نمایند و ﻳﺎ از ﺗﻔﻜﻴﻚ کمپلکس‌های ﭘﺮوﺗﺌﻴﻨﻲ و ﻳﺎ غیرفعال ﺷﺪه آنزیم‌ها ﺟﻠﻮﮔﻴﺮي ﻛﻨﻨﺪ (زانگ و همکاران،1996).

در ﺑﺮاﺑﺮ ﺗﻨﺶ ﺧﺸﻜﻲ واﻛﻨﺶ ﻋﻤﻮﻣﻲ ﺗﺠﻤﻊ ﻣﻮاد ﺣﻞ ﺷﻮﻧﺪه ﺳﺎزﮔﺎر ﺻﻮرت می‌گیرد ﻛﻪ ﺑﺴﻴﺎري از آن‌ها اﺳﻤﻮﻟﻴﺘﻬﺎ ﻫﺴﺘﻨﺪ ﻛﻪ ﺑﺎﻋﺚ ﺗﻨﻈﻴﻢ اﺳﻤﺰي می‌شود. ﺗﺠﻤﻊ و ﻧﻮع ﻣﺎده ﺣﻞ ﺷﻮﻧﺪه در ﺑﺮاﺑﺮ ﺗﻨﺶ ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮر ﺳﺎزﮔﺎري در گونه‌های ﻣﺨﺘﻠﻒ ﻣﺘﻔﺎوت اﺳﺖ ﻛﻪ ﺷﺎﻣﻞ آﻣﻴﻨﻮاﺳﻴﺪﻫﺎ (پرولین), ﻗﻨﺪﻫﺎ (ساکارز، فروکتان) ﭘﻠﻲ مر‌ها (مانیتور، سوربیتول) اسیدآمینه‌ (ﮔﻼﻳﺴﻴﻦ، ﺑﺘﺎﺋﻴﻦ) یون‌ها (ﭘﺘﺎﺳﻴﻢ)، اﺳﻴﺪﻫﺎي آﻟﻲ (مالت و ﻧﻴﺘﺮات) می‌باشند؛ مثل ﺗﺠﻤﻊ ﮔﻼﻳﺴﻴﻦ ﺑﺘﺎﺋﻴﻦ در ﺑﺮاﺑﺮ ﺗﻨﺶ اﺳﻤﺰي ﺧﺼﻮﺻﻴﺖ ﺑﺎرز در ﺧﺎﻧﻮاده Plumbaginaceae است درحالی‌که در ﺗﻨﺒﺎﻛﻮ و ﺑﺮﻧﺞ ﺳﻴﺮ ﺑﻴﻮﺳﻨﺘﺰي ﮔﻼﻳﺴﻴﻦ بتائین دیده ﻧﺸﺪه اﺳﺖ (صفر نژاد، 1996؛رونتین همکاران، 2002). ﻛﻤﺒﻮد آب ﺳﺒﺐ ﺑﻴﺎن ژن‌های ﺧﺎص می‌شود و ﺑﻴﺎن اﻳﻦ ژن‌ها ﺑﺎ پاسخ‌های ﺳﺎزﮔﺎري ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺗﺤﺖ تنش در ارﺗﺒﺎط اﺳﺖ (شین واری،2000). ﺗﻨﺶ آب ﺑﻪ ﺳﺒﺐ ﺗﻐﻴﻴﺮات ﺑﻴﺎن ژن‌ها در ﮔﻴﺎﻫﺎن به‌رغم ﻛﺎﻫﺶ ﺳﻨﺘﺰ ﭘﺮوﺗﺌﻴﻦ ﻛﻞ ﺑﺎﻋﺚ ﺗﻮﻟﻴﺪ پروتئین‌های ویژه‌ای می‌گردد ﻛﻪ سلول‌ها و به‌طورکلی ﮔﻴﺎه را در برابر تنش ﻣﺤﺎﻓﻈﺖ می‌کنند (صفرنژاد،1996). اﻳﻦ پروتئین‌ها ﺷﺎﻣﻞ چاپرون‌ها، LEAs (Late embryogenesis, abundant) اﺳﻤﻮﺗﻴﻦ و پروتئین‌های ﺿﺪ ﻳﺨﺰدﮔﻲ، پروتئین‌های متصل به mRNA و آنزیم‌های ﻛﻠﻴﺪي ﺑﺮاي بیوسنتزی اﺳﻤﻮﻟﻴﺘﻬﺎ، پروتئین‌های ﻛﺎﻧﺎل آب، ﻧﺎﻗﻠﻴﻦ پرولین و ﻗﻨﺪﻫﺎ و آنزیم‌های سم‌زدا می­باشند. پروتئین‌های LEA،پروتئین‌های ﻣﺘﺼﻞ ﺑﻪ mRNA و چاپرون‌ها در ﻣﺤﺎﻓﻈﺖ ماکرو مولکول‌هایی ﻫﻤﭽﻮن آنزیم‌ها، ﻟﻴﭙﻴﺪﻫﺎ و mRNA در ﺑﺮاﺑﺮ دﻫﻴﺪراﺳﻴﻮن دﺧﺎﻟﺖ دارﻧﺪ.پرولین، ﮔﻼﻳﺴﻴﻦ ﺑﺘﺎﺋﻴﻦ و ﻗﻨﺪﻫﺎ به‌عنوان اسمولیتها ﻋﻤﻞ ﻛﺮده و از سلول‌ها در برابر دهیدراسیون ﻣﺤﺎﻓﻈﺖ می‌نماید. پروتئین‌های ﻛﺎﻧﺎل آب، ﻧﺎﻗﻠﻴﻦ ﻗﻨﺪﻫﺎ و ﻧﺎﻗﻠﻴﻦ پرولین در اﻧﺘﻘﺎل آب، ﻗﻨﺪﻫﺎ و پرولین ﺑﺎ ﻋﺒﻮر از ﻋﺮض ﻏﺸﺎﻫﺎي ﭘﻼﺳﻤﺎﻳﻲ و ﺗﻮﻧﻮﭘﻼﺳﺖ در ﺗﻨﻈﻴﻢ ﻓﺸﺎر اﺳﻤﺰي ﺗﺤﺖ ﺷﺮاﻳﻂ ﺗﻨﺶ ﻋﻤﻞ می‌کنند. آنزیم‌های سم‌زدا شامل سوپر اکسيد دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، آسکوربات پراکسیداز (APX) و گلوتاتيون ردوکتاز (GR) می‌باشند در ﻣﺤﺎﻓﻈﺖ ﺳﻠﻮل در ﺑﺮاﺑﺮ اﻛﺴﻴﮋن ﻓﻌﺎل ﻋﻤﻞ می‌کند (یاماگیچی،2002). ﺗﻮﻟﻴﺪ پروتئین‌های دﻳﮕﺮ ﻧﻴﺰ در ﺑﺮاﺑﺮ ﺗﻨﺶ آب ﻫﻤﭽﻮن (responsive to ABA) RABsdehydrins و پروتئین‌های ذﺧﻴﺮه روﻳﺸﻲ در ﮔﻴﺎﻫﺎن ﻣﺨﺘﻠﻒ گزارش‌شده‌اند (Artlip and Funkhouser,1995).
سيستم غير آنزيمی که شامل آسکوربات، توكوفرول، كاروتنوئيدها و تركيبات متفرقه (ازجمله فلاونوئيدها، مانیتورها و پلي فن‌ها) نیز وجود دارد (بلوخین،2003). تعدد و کثرت سيستم­های دفاعی به اين خاطر است که انواع اکسيژن‌های واکنش زا (ROS) در سلول‌ها توليد می‌شوند و هم‌چنین در خاصيت­هایی چون توانائی انتشار، حلاليت و تمایل به واکنش با مولکول­های بيولوژيک مختلف را دارند. بنابراين به مجموعه‌ای به‌هم‌پیوسته از مولکول­های دفاعی برای عمل در هر دو مرحله آلی و غشائی در تمام بخش­های سلول برای غیرفعال کردن رادیکال‌ها به همان سرعتی که آن‌ها شکل می‌گیرند، نياز است. تحقيقات مختلف نشان داده است که يک ارتباط قوی بين تحمل به تنش‌های اکسيداتيو و افزايش غلظت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در گياهان فتوسنتز کننده وجود دارد (سایرام، 2002). محققين نشان داده‌اند که غلظت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در شرایط تنش دو برابر شده و لذا باعث افزايش مقاومت به تنش‌های اکسيداتيو می‌شوند و از طرفی تنش خشکی نيز ميزان فعاليت آنزيم گلوتاتيون ردوکتاز و سوپر اکسيد دیسموتاز را افزايش می‌دهد (گامبل و همکاران،1984؛لاسکانو و همکاران 2005). اصغری و همکاران نيز با قرار دادن گیاهچه­های دو رقم گندم در معرض تنش خشکی گزارش کردند که رقم مقاوم به تنش از فعاليت بالاتر آنزيم آسکوربات پراکسیداز در مقايسه با رقم حساس برخوردار بود (شری و همکاران، 2000). اين محققين اظهار داشتند که تنش خشکی سبب کاهش بيشتر در مقدار آب نسبی (RWC) رقم حساس گرديد.

1-2-3 آنزیم‌ها

آنزیم­ها کاتالیزورهای حیاتی و تمام پپتیدی یا پروتئینی هستند که توسط سلول زنده سنتز شده و عمل کاتالیز واکنش‌های بیوشیمیایی را در داخل یا خارج سلول بر عهده‌دارند. آنزیم­ها اختصاصی‏ترین پروتئین­هایی هستند که می‏توان فعالیت آن­ها را به‌صورت کاتالیز واکنش‌های بیوشیمیایی نشان داد. این ترکیبات دارای ۲ خاصیت مهم هستند:

1- کاتالیز کردن واکنش‌های بیوشیمیایی و افزایش سرعت این واکنش­ها.

2- عمل کردن اختصاصی بر روی پیش ماده، آنزیم­ها چنان اختصاصی عمل می‏کنند که می‏توانند موادی را که دارای گردش نوری متفاوت هستند از یکدیگر بازشناخته و فقط بر روی ۱ نوع ایزومر نوری عمل کنند.

در ساختمان آنزیم محلی مخصوص، که به آن جایگاه فعال می‏گویند وجود دارد. این جایگاه و همچنین شکل و گروه‌های شیمیایی ساختار آنزیم موجب می‏گردند که یک آنزیم به‌طور اختصاصی بر روی یک سوبسترا عمل کند. ازنظر ساختمانی آنزیم­ها را به دودسته تقسیم می‏کنند. تعدادی از آنزیم‌ها فعالیتشان تنها به ساختمان پروتئینی بستگی دارد، درحالی‌که برخی دیگر از آنزیم­ها برای انجام فعالیت­های کاتالیزوری خود به ترکیبات فعال‌کننده غیر پروتئینی (کوفاکتور) نیاز دارند. کوفاکتورها نیز بر دو نوع می‌باشند:

1- کوفاکتورهایی که تنها شامل یک یون فلزی مانند Zn⁺⁺، Mg⁺⁺، Mn⁺⁺، Cu⁺⁺، Fe⁺⁺، Na⁺ و یا k⁺می‌باشند. این‌گونه کوفاکتورها به دو صورت عمل می‏کنند.

الف: کوفاکتور نقش یک واسطه را برای پیوند مولکول‌های آنزیم با سوبسترا بر عهده‌دارند.

ب: برخی از کوفاکتورها خود در عمل کاتالیز شرکت می‏نمایند. از این جمله می‏توان فلز آهن را در آنزیم کاتالاز مثال زد.

2- کوفاکتورهایی که از یک مولکول ترکیب آلی تشکیل یافته‏اند، این‌گونه کوفاکتورها را کو آنزیم می‏نامند.

کوفاکتورها اغلب با پیوند ضعیف و کم انرژی به قسمت پروتئینی آنزیم اتصال یافته است، ولی در بعضی موارد مشاهده می‏شود که این اتصال توسط پیوندهای کووالان انجام‌گرفته است. این‌گونه کوآنزیم­ها را گروه پروستتیک می‏نامند. بیشتر کوآنزیم­ها از مشتقات ویتامین­های محلول در آب می‌باشند. کوآنزیم­ها عموما در مقابل حرارت مقاوم می‌باشند، درحالی‌که قسمت پروتئینی (آپوآنزیم) در برابر حرارت ناپایدار و آسیب‌پذیر است.

 

1-2-3-1 اصول کلی واکنش­های آنزیمی

الف: در واکنش‌های بیوشیمیایی که توسط آنزیم کاتالیز می‏ گردند، معمول سه عامل شرکت دارند:

1- سوبسترا یا جسمی که تحت تاثیرداشته آنزیم قرار می‌گیرد.

2- آنزیم یا ترکیبی که از آنزیم و کوفاکتور که بر روی سوبسترا اثر نموده و واکنش را کاتالیز می‏کند.

3- محصول که در جریان واکنش تولید می‏شود.

ب: آنزیم در طی واکنش به مصرف نرسیده و بدون هیچ‌گونه تغییری در خاتمه واکنش آزاد می‏گردد.

1-2-3-2 سوپراکساید دیسموتاز

سوپراکسایددیسموتاز ها خط اول دفاعی گیاهان علیه رادیکال­های آزاد اکسیژن در درون سلول می‌باشند (افشر، 2002). سوپراکسایددیسموتاز آنزیمی متعلق به خانواده متالوآنزیم­ها است که رادیکال­های سوپراکساید را به پراکسیدهیدروژن و مولکول اکسیژن تبدیل می‏کند. این واکنش توسط کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز ادامه می‏یابد یعنی آن‌ها پراکسیدهیدروژن را به آب و اکسیژن تجزیه می‏نمایند و بدین ترتیب از تجمع رادیکال­های سوپراکساید که برای سلول­ها بسیار مخرب هستند، جلوگیری می‏نمایند (بی‌سر و همکاران،1991، بلوخینا و همکاران، 2003). سوپراکساید در هرجایی که چرخه انتقال الکترون وجود داشته باشد تولید می‏شود، بنابراین برانگیختگی اکسیژن می‏تواند در هر بخشی از سلول ازجمله میتوکندری، کلروپلاست، گلی‌اکسیزوم، پراکسی زوم، آپوپلاست و سیتوسل رخ دهد، درنتیجه نباید از وجود سوپراکساید دیسموتاز در تمام این اندامک­ها شگفت‌زده شد (افشر، 2002). بر اساس نتایج مطالعات آسادا و تاکاهاشی (1987)، غشاهای فسفولیپیدی توانایی تراوش مولکول‌های O₂^- را ندارند، بنابراین وجود سوپراکساید دیسموتاز در محلی که مولکول‌های ^-O₂ تولید می‏شوند بسیار حیاتی است. افزایش بیشتر مقادیر آنزیم سوپراکساید دیسموتاز در واریته­های متحمل نخود، پنبه، گوجه‌فرنگی و ... در مقایسه با واریته­های حساس، می‏تواند دلیلی برای نقش مهم این آنزیم برای مقابله با تنش خشکی باشد (میتووا وهمکاران، 2002). برای توجیه این مسئله، به نظر می‏رسد که بالاتر ب